مجمع النسخ المتماثل لفيروس كورونا: NMPylation المهم والانتقائي للوحدات الفرعية NiRAN-RdRp للمواقع المحفوظة في nsp9

حرره بيتر سارنو، كلية الطب بجامعة ستانفورد، جامعة ستانفورد، كاليفورنيا، تمت الموافقة عليه في 25 ديسمبر 2020 (تمت المراجعة في 25 أكتوبر 2020)

قمنا بالإبلاغ عن التفاعل بين الوحدات الفرعية في تكرار مجمعات نسخ الفيروسات التاجية، والتي تعتبر ضرورية للتكاثر والحفظ التطوري.لقد قدمنا ​​دليلًا على أن مجال NiRAN المرتبط بـ nsp12 له نشاط ترانسفيراز أحادي الفوسفات (NMP) في النقل، وحددنا nsp9 (بروتين ربط RNA) كهدف له.يقوم NiRAN بتحفيز الارتباط التساهمي لشحنة NMP بالنهاية الأمينية nsp9 المحفوظة في تفاعل يعتمد على أيونات Mn2+ وبقايا Asn المحفوظة المجاورة.وقد وجد أن نشاط NiRAN وnsp9 NMPylation ضروريان لتكاثر فيروس كورونا.تسمح لنا البيانات بربط هذا النشاط لعلامة إنزيم الفيروس المتداخل بالملاحظات السابقة في الفرضية القائلة بأن بدء تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) في فئة من فيروسات الحمض النووي الريبي (RNA) يكون متسقًا وظيفيًا وتطوريًا.

يرتبط بوليميريز الحمض النووي الريبي (RdRps) المعتمد على الحمض النووي الريبي (RdRps) لفيروسات Nidoviridae (الفيروسات التاجية والفيروسات الشريانية و12 عائلة أخرى) بمجال الطرف الأميني (N-terminal) في البروتين غير الهيكلي (nsp) المنطلق من البروتين المتعدد، المسمى NiRAN يتكون 1ab من البروتياز الفيروسي الرئيسي (Mpro).في السابق، تم الإبلاغ عن نشاط GMPylation/UMPylation الخاص بالفيروس الشرياني NiRAN-RdRp nsp، واقترح إنشاء عابر لنقل أحادي فوسفات النيوكليوزيد (NMP) إلى الفيروس (غير المعروف حاليًا) و/أو أشياء البلمرة الحيوية للخلية.نوضح هنا أن فيروس كورونا (فيروس كورونا البشري [HCoV] -229E ومتلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة فيروس كورونا 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) له نشاط NMPylation المعتمد على Mn2+، والمشتق من nsp9 من خلال تكوين nsp9 بوساطة Mpro. يتم إطلاق NSPS المرافق للطرف N بشكل بروتيني، ويرتبط الفوسفورميدات بالأمين الأولي (N3825) عند الطرف N لـ nsp9.يوريدين ثلاثي الفوسفات هو النوكليوتيدات المفضلة في هذا التفاعل، لكن أدينوسين ثلاثي الفوسفات، وجوانوسين ثلاثي الفوسفات، وثلاثي فوسفات السيتدين هي أيضًا ركائز مشتركة مناسبة.حددت دراسات الطفرة باستخدام بروتينات فيروس كورونا المؤتلف nsp9 وnsp12 وطفرات HCoV-229E المعدلة وراثيًا المخلفات اللازمة لـ nsp9 NMPylation بوساطة NiRAN وتكاثر الفيروس في زراعة الخلايا.أكدت البيانات التنبؤ ببقايا موقع NiRAN النشط وحددت الدور الهام لبقايا nsp9 N3826 في nsp9 NMPylation وتكاثر الفيروس في المختبر.تعد هذه البقايا جزءًا من تسلسل N-terminal NNE ثلاثي الببتيد المحفوظ، وقد ثبت أنها البقايا الثابتة الوحيدة لـ nsp9 ومماثلاته في عائلة فيروسات التاجية.توفر هذه الدراسة أساسًا متينًا للدراسة الوظيفية لنشاط NMPylation للفيروسات المتداخلة الأخرى وتقترح أهدافًا محتملة لتطوير الأدوية المضادة للفيروسات.

يصيب فيروس الحمض النووي الريبوزي RNA إيجابي الجديلة مجموعة متنوعة من الفقاريات واللافقاريات (1، 2).وتضم الترتيب حاليًا 14 عائلة (3)، تمت دراسة عائلة فيروس كورونا منها على نطاق واسع خلال العشرين عامًا الماضية.في ذلك الوقت، ظهرت ثلاثة فيروسات تاجية حيوانية المصدر من الحيوانات المضيفة وتسببت في تفشي التهابات الجهاز التنفسي الحادة لدى البشر على نطاق واسع.بما في ذلك الأوبئة المستمرة الناجمة عن الأمراض المعدية الحادة الوخيمة.متلازمة الجهاز التنفسي فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).تشترك فيروسات Nidovirus في تنظيم جينوم مشترك، ويتم تشفير الوحدة الفرعية لمجمع النسخ والنسخ المرتبط بالغشاء (RTC) في الثلثين الطرفيين 5-² والوحدة الفرعية الهيكلية الرئيسية لجسيم الفيروس، بالإضافة إلى بعض الملحقات. .البروتين المشفر في الثلث الأخير من الجينوم (1).باستثناء عائلة واحدة من فيروسات المستورقات (Monoviridae) (8)، تقوم جميع الفيروسات المتداخلة بتشفير وحدات RTC الفرعية في إطارين كبيرين للقراءة المفتوحة (ORF) ORF1a وORF1b، والتي يتم ترجمتها من الحمض النووي الريبي الجينومي لـ.يقوم ORF1a بتشفير البروتين المتعدد (pp) 1a، ويقوم ORF1a وORF1b معًا بتشفير pp1ab.من خلال المشاركة العامة للبروتياز الرئيسي (Mpro) المشفر بواسطة ORF1a، تتم معالجة كل من pp1a وpp1ab بروتينيًا إلى مجموعة متنوعة من البروتينات غير الهيكلية (nsps)، المعروفة أيضًا باسم 3CLpro، لأنه يحتوي على تماثل مع 3Cpro لفيروس بيكورنافيروس ( 9).يُعتقد أن هذه nsps يتم تجميعها في RTC ديناميكي كبير، وتحفز تخليق الحمض النووي الريبي الجينومي (النسخ المتماثل) ومجموعة من الحمض النووي الريبي تحت الجينومي (النسخ)، وتستخدم لتنسيق التعبير عن ORF الموجود أسفل ORF1b (10؟ 12).

يشتمل RTC الأساسي على بوليميريز RNA المعتمد على RNA (RdRp) (13)، وهيليكاز 1 الفائقة (HEL1) (14، 15) والعديد من إنزيمات معالجة RNA، والتي يتم تشفيرها بشكل أساسي في ORF1b وفي عائلة الفيروسات التاجية التي تحتوي على nsp12-nsp16 و nsp9-nsp12 في عائلة الفيروسات الشريانية (انظر المرجع 10-12).يمثل RdRp وHEL1 مجالين محفوظين (الخمس) من فيروس عش الطائر ولهما تماثل بين فيروسات الحمض النووي الريبي (RNA) الأخرى.يُعتقد أن النسخ المتماثل الأساسي مدعوم بوحدات فرعية أخرى، بما في ذلك العديد من nsps الصغيرة المنطلقة من منطقة محطة الكربوكسي (C-terminal) لـ pp1a، أسفل Mpro (فيروس كورونا nsp5 والفيروس الشرياني nsp4، على التوالي).لديهم حماية محدودة خاصة بالأسرة وأنشطة متنوعة (تمت مراجعتها في المرجع 10-12).

في الآونة الأخيرة نسبيًا، تم العثور على مجال ذو خصائص عزر تسلسلي فريد عند الطرف الأميني (N-terminus) المجاور لـ RdRp في جميع الفيروسات المتداخلة، ولكن لا توجد فيروسات RNA أخرى (16).استنادًا إلى موقعه ونشاط ترانسفيراز النيوكليوتيدات (ترانسفيراز أحادي الفوسفات [NMP])، يُسمى هذا المجال NiRAN (ترانسفيراز النيوكليوتيدات المرتبط بفيروس Nestvirus RdRp).يشكل مزيج المجال المزدوج لـ NiRAN-RdRp nsp12 في عائلة الفيروسات التاجية وnsp9 في عائلة الفيروسات الشريانية، وفي الفيروسات العشية الأخرى، من المتوقع أن يتم إطلاق NiRAN-RdRp باعتباره nsp مستقلاً عن البروتين الفيروسي.في فيروس كورونا، يحتوي مجال NiRAN على 1/450 من الوحدات البنائية وهو متصل بمجال C-terminal RdRp من خلال منطقة الرابط (16؟19).في فيروس التهاب الشرايين الخيولي (EAV) (Arteriviridae)، يُظهر nsp9 المؤتلف أنشطة UMPylation وGMPylation المعتمدة على الأيونات Mn2+، والتي تعتمد على ثلاث قواعد تسلسلية محفوظة في فيروس Nestovirus، AN وBN وCN البقايا في التسلسل.حيث يشير N إلى NiRAN) (16).إن الجانب N- الطرفي لهذه الزخارف هو عزر أقل تحفظًا preAN.يتم أيضًا حفظ بعض هذه المخلفات في كينازات البروتين ذات الصلة البعيدة، حيث ثبت أنها متورطة في النشاط التحفيزي والارتباط بالنيوكليوزيد ثلاثي الفوسفات (NTP) (20، 21).تمشيًا مع هذه الملاحظة، يمكن تجميع العديد من بقايا الموقع النشط الرئيسية في pseudokinase SelO من Pseudomonas syringae باستخدام مركب SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 الفائق المنشور مؤخرًا.بقايا فيروس كورونا NiRAN المحفوظة متراكبة في البنية المجهرية الإلكترونية.البروتين المؤتلف (17).من المتوقع أن U/GMPylation الموثق (الذاتي) سوف ينتج حالة عابرة لنقل NMP إلى الركيزة (غير المعروفة حاليًا) (16)، والتشابه الهيكلي بين NiRAN وبروتين كيناز (17، 19)) هو الفرضية القائلة بأن يقوم NiRAN بتعديل البروتينات الأخرى.

العديد من الميزات، بما في ذلك ارتباطه المنهجي الفريد والفريد بالفيروسات المتداخلة والفصل الجيني عن RdRp، تجعل من NiRAN إنزيمًا تنظيميًا رئيسيًا معقولًا للفيروسات المتداخلة، وهو أمر بالغ الأهمية لظهورها وهويتها.في السابق، تم استدعاء ثلاث وظائف محتملة تتضمن NiRAN لتنظيم ترجمة الجينوم/الجينوم الفرعي أو النسخ المتماثل/النسخ.عند النظر في البيانات النادرة وغير الكاملة المتاحة في ذلك الوقت، فإن كل وظيفة لها مزاياها وعيوبها (16).نهدف في هذا البحث إلى الجمع بين الدراسات الكيميائية الحيوية والدراسات الوراثية العكسية لفيروسات كورونا التي تمثل الجنسين، ووضع النتائج التي توصلنا إليها في الخلفية التطورية للطفرة الطبيعية لعائلة الفيروسات التاجية، وذلك للحصول على نظرة ثاقبة لهذا العالم الغامض.لقد أبلغنا عن تطورات كبيرة في فهم NiRAN من خلال تحديد الأهداف الطبيعية في RTC، والتي تساهم (من بين الفرضيات الثلاثة المتاحة) في دور هذا المجال في بدء تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) للفيروس المتداخل.يفتح هذا البحث أيضًا إمكانيات لأدوار أخرى لـ NiRAN على واجهة مضيف الفيروس.

من أجل توصيف الخصائص الأنزيمية لمجال NiRAN المرتبط بفيروس كورونا nsp12، أنتجنا شكلًا مؤتلفًا من فيروس كورونا البشري 229E (HCoV-229E) nsp12 في الإشريكية القولونية، مع علامة His6 عند الطرف C، وقمنا بدمج احتضان البروتين مع [α32-P] مع NTP في وجود MnCl2 كما هو موضح في المواد والأساليب.أشار تحليل منتج التفاعل إلى وجود بروتين ذو علامة إشعاعية يهاجر مع nsp12 (106 كيلو دالتون)، مما يشير إلى أن فيروس كورونا nsp12 يحفز تكوين مقاربات البروتين التساهمي-NMP، والتي يتم تشكيلها بشكل تفضيلي مع أحادي فوسفات اليوريدين (UMP) (الشكل 1A). ب).أظهر التحليل الكمي أنه بالمقارنة مع النيوكليوتيدات الأخرى، زادت شدة إشارة دمج UMP بمقدار 2 إلى 3 مرات (الشكل 1C).تتوافق هذه البيانات مع نشاط NMP Transferase المتوقع لمجال NiRAN لفيروس كورونا (16)، ولكنها تشير إلى أن تفضيلات النوكليوتيدات لمجال NiRAN لفيروس كورونا والفيروس الشرياني مختلفة.

نشاط NMPylation الذاتي لـ HCoV-229E nsp12.(A) تم تحضين HCoV-229E nsp12-His6 (106 كيلو دالتون) مع NTP المعين [α-32P] في وجود 6 ملي مولار MnCl لمدة 30 دقيقة (انظر المواد والطرق للحصول على التفاصيل).تم فصل منتجات التفاعل بواسطة SDS-PAGE وصبغها باللون الأزرق اللامع Coomassie.(ب) يتم تصور البروتين المسمى بالإشعاع بواسطة التصوير الفوسفوري.تظهر مواقف nsp12-His6 وعلامات الكتلة الجزيئية للبروتين (بالكيلودالتون) في A وB. (C) تم تحديد شدة الإشارة المشعة (يعني ± SEM) من ثلاث تجارب مستقلة.* P ≥0.05.ترتبط قوة الإشارة (النسبة المئوية) بـ UTP.

على الرغم من أن أنشطة الإنزيمات المرتبطة بـ NiRAN أثبتت أنها ضرورية لتكرار EAV وSARS-CoV في زراعة الخلايا (16)، إلا أن وظيفة NiRAN المحددة والأهداف المحتملة لم يتم تحديدها بعد.دفعنا التشابه الهيكلي الذي تم الإبلاغ عنه مؤخرًا بين NiRAN وعائلة من البروتينات ذات الطيات الشبيهة بالبروتين كيناز (17، 22) إلى اختبار الفرضية القائلة بأن NiRAN يحفز NMPylation للبروتينات الأخرى.لقد أنشأنا مجموعة من الأهداف المتماثلة المحتملة، بما في ذلك البروتينات غير الهيكلية المشفرة بواسطة HCoV-229E ORF1a (nsps 5، 7، 8، 9، 10)، يحتوي كل منها على علامة C-terminal His6 (ملحق SI، الجدول S1)، و احتضان هذه البروتينات مع [α32-P] ثلاثي فوسفات اليوريدين ([α32-P]UTP) في وجود أو عدم وجود nsp12.خدم ألبومين المصل البقري وبروتين الاندماج MBP-LacZα المنتج في E. coli كعناصر تحكم (الشكل 2A، الممرات من 1 إلى 7).تم تحليل البروتين المسمى إشعاعيًا بواسطة الفصل الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) والتصوير الشعاعي الذاتي، وتبين وجود إشارة إشعاعية قوية في التفاعل الذي يحتوي على nsp12 وnsp9.يتوافق موضع الإشارة مع الكتلة الجزيئية لـ nsp9، مما يشير إلى UMPylation بوساطة nsp12 لـ nsp9 (الشكل 2B، المسار 7).لم يتم العثور على أي بروتينات اختبار أخرى غير متجانسة، مما دفعنا إلى استنتاج أن nsp9 هو ركيزة محددة لـ nsp12.بما يتوافق مع بيانات NMPylation الذاتية الموضحة في الشكل 1، فإن nsp12 قادر على نقل جميع NMPs الأربعة إلى nsp9، على الرغم من اختلاف الكفاءة، UMP> أحادي فوسفات الأدينوزين (AMP)> أحادي فوسفات الجوانوزين (GMP)> أحادي فوسفات السيتيدين (CMP) ) ( صورة).3 أ و ب).في ظل الظروف المستخدمة في هذا الاختبار (تقصير وقت التفاعل والتعرض، وتقليل تركيز nsp12؛ المواد والأساليب)، لا يمكن اكتشاف NMPylation الذاتي لـ nsp12 (قارن الشكل 2B، الخط 7، والشكل 1B)، والذي أثبت UMP فعاليته (وجولاته المتعددة) في الانتقال من nsp12 إلى nsp9.يتطلب نشاط ترانسفيراز UMP وجود أيونات Mn2+، كما هو مبين في الشكل 3C، في حين لوحظ الحد الأدنى فقط من نشاط ترانسفيراز UMP في وجود Mg2+، ولم يتم اختبار أي نشاط في وجود الكاتيونات الثنائية التكافؤ الأخرى.تم الحصول على بيانات مماثلة في فحوصات NMPylation التي تحتوي على سيتيدين ثلاثي الفوسفات (CTP)، وثلاثي فوسفات الغوانوسين (GTP)، وثلاثي فوسفات الأدينوزين (ATP) (ملحق SI، الشكل S1).

HCoV-229E nsp12 بوساطة UMPylation لـ nsp9.تم استخدام سلسلة من ركائز البروتين (بما في ذلك ألبومين المصل البقري، MBP-lacZα، وسلسلة من HCoV-229E nsps المسمى بـ C-terminal His6 المشفر بواسطة ORF1a) لتقييم نشاط UMPylation لـ HCoV-229E nsp12-His6⁺ بوساطة بروتين.احتضان البروتين مع [α-32P] UTP لمدة 10 دقائق في غياب (A) أو وجود (B) من nsp12 كما هو موضح في المواد والأساليب.في الجزء العلوي من A وB، يظهر جل SDS-polyacrylamide الملون باللون الأزرق Coomassie Brilliant Blue، وفي الجزء السفلي من A وB، يتم عرض الصور الشعاعية المقابلة.يتم إعطاء موضع علامة الكتلة الجزيئية للبروتين (بالكيلودالتون) على اليسار.يشار أيضًا إلى موضع nsp12-His6 (B، أعلى) والإشارة المشعة التي لوحظت أثناء حضانة nsp12-His6 مع nsp9-His6 (B، الخط 7)، مما يشير إلى أن [α-32P] UMP إلى nsp9-His6 (12.9 كيلو دالتون)، وهو ما لم تتم ملاحظته بالنسبة للبروتينات الأخرى التي تم اختبارها.

HCoV-229E NiRAN التوصيف الكيميائي الحيوي والفيروسي لـ nsp9 NMPylation.(أ و ب) دور الركيزة المشتركة للنيوكليوتيدات المستخدمة في التفاعل.يتم خلط Nsp12-His6 وnsp9-His6 واحتضانهما في وجود NTPs [α-32P] مختلفة في اختبار NMPylation القياسي.(أ، أعلى) nsp9-His6 الملطخة بـ Coomassie مفصولة بـ SDS-PAGE.(أ، أسفل) تصوير شعاعي ذاتي لنفس المنطقة من الجل.(ب) يتم تحديد النشاط النسبي (يعني ± SEM) في وجود العامل المساعد النوكليوتيدات المعين من ثلاث تجارب مستقلة.* P ≥0.05.(ج) دور أيونات المعادن.يظهر اختبار NMPylation القياسي في وجود [α-32P] UTP وأيونات معدنية مختلفة، كل منها بتركيز 1 مم.في C، يظهر الجزء العلوي، Coomassie nsp9-His6 الملون، وفي C، الجزء السفلي، يظهر التصوير الشعاعي الذاتي المقابل.يظهر حجم البروتين المسمى (بالكيلودالتون) على يسار A وC. (D) الشكل المتحور لـ HCoV-229E nsp12-His6 الذي يحمل استبدال الأحماض الأمينية المحدد موجود في [α-32P]UTP، كما هو موصوف في المواد والأساليب.تم الكشف عن nsp9-His6 المسمى إشعاعيًا والذي تم إنتاجه في تفاعل NMPylation بواسطة تصوير الفسفرة (D، أعلى).يظهر النشاط النسبي مقارنة بالبروتين من النوع البري (بالوزن) في D، ويتم أخذ الجزء السفلي كمتوسط ​​(±SEM) من ثلاث تجارب مستقلة.تشير العلامات النجمية إلى بدائل المخلفات غير المحفوظة.(E) تم تحديد عيار الفيروس في طاف الثقافة لخلايا P1 بعد 24 ساعة من الإصابة عن طريق فحص البلاك.تتم الإشارة إلى بدائل الكودون في مجال NiRAN الخاص بمتحول HCoV-229E المصمم هندسيًا (يعتمد ترقيم البقايا على موضعها في pp1ab).تم استخدام موقع RdRp النشط الناقص في النسخ المتماثل nsp12_DD4823 / 4AA كعنصر تحكم.

من أجل الحصول على فهم أعمق للموقع النشط لـ NiRAN وتحديد المخلفات المرتبطة بنشاط NMP Transferase الخاص بـ nsp9، أجرينا تحليل الطفرة، حيث استبدلنا المخلفات المحافظة في أشكال NiRAN AN وBN وCN ( 16) إنه علاء (ملحق SI، الشكل S2).بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم تأثير بدائل Arg-to-Lys أو Lys-to-Arg المحافظة في حالتين.كعنصر تحكم (سلبي)، يتم استبدال المخلفات التي لم يتم حفظها أو أقل حفظًا في مجال NiRAN للفيروسات التاجية والفيروسات المتداخلة الأخرى بـ Ala. استبدال K4116A (في نموذج preAN)، K4135A (AN)، R4178A (BN)، D4188A (نموذج BN) وD4280A (CN) يقللان بشكل كبير أو حتى يزيلان nsp9 NMPylation من خلال nsp12، في حين تحتفظ البروتينات ذات البدائل المحافظة (R4178K)، K4116R) بـ 60٪ و80٪ من نشاطها، مما يشير إلى أن تخفيف القيود على جانب كل منها السلاسل حساسة من الناحية الفيزيائية والكيميائية (الشكل 3D).يعد استبدال العديد من المخلفات المحفوظة الأخرى E4145A وD4273A وF4281A وD4283A أقل ضررًا بكثير، ويتم تقليل nsp9 UMPylation بشكل معتدل فقط.تم الحصول على نتائج مماثلة في تفاعلات nsp9 NMPylation التي تتضمن NTPs أخرى (الشكل 3D وملحق SI، الشكل S3)، مما يؤكد أن التأثيرات الملحوظة على بدائل الأحماض الأمينية المحددة مستقلة عن نوع الركيزة المشتركة للنيوكليوتيدات المستخدمة.بعد ذلك، قمنا باختبار التأثير المحتمل لبدائل nsp12 على تكاثر فيروسات كورونا في مزرعة الخلايا.ولتحقيق هذه الغاية، استخدمنا قوالب الحمض النووي التكميلي (cDNA) المناسبة المهندسة وراثيًا والمستنسخة في فيروس اللقاح المؤتلف (23، 24) لنسخ 5-7 خلايا.وأظهرت معايرة ذرية الفيروس المعدي المنتجة في هذه الخلايا أن معظم طفرات HCoV-229E NiRAN لم تكن ممكنة (الشكل 3E).تشتمل مجموعة من الطفرات الفيروسية غير القابلة للحياة على بدائل ثبت أنها تقضي على نشاط ترانسفيراز NMP أو تقلله بشكل كبير في المختبر (K4116A، K4135A، R4178A، D4188A، ​​D4280A، D4283A)، ولكن هناك بديلان آخران (K4116R، E4145A) 80 ٪ محجوز؟ويشير نشاطهم في NMPylation في المختبر إلى وجود قيود إضافية.وبالمثل، أنتجت طفرات أخرى (R4178K، F4281A) التي تسببت في انخفاض معتدل في نشاط NMPylation لـ NiRAN في المختبر، فيروسات حية، ومع ذلك، خفضت هذه الفيروسات التتر بشكل كبير من خلال التكاثر.بما يتوافق مع بيانات النشاط المختبري الموضحة في الشكل ثلاثي الأبعاد، تم استبدال أربعة بقايا أخرى لم يتم حفظها في فيروس كورونا و/أو فيروسات متداخلة أخرى (K4113A، D4180A، D4197A، D4273A) (8، 16) بإنتاج فيروسات قابلة للحياة، على الرغم من وجود ذرية عيار مخفض بشكل معتدل مقارنة بفيروس النوع البري (الشكل 3E).

من أجل دراسة ما إذا كان نشاط ترانسفيراز NMP بوساطة NiRAN يعتمد على مجال RdRp النشط، تم استبدال بقايا Asp المحفوظة المشاركة في تنسيق أيونات المعادن ثنائية التكافؤ (11) في نموذج RdRp C بـ Ala. ويحتفظ البروتين الناتج nsp12_DD4823/4AA نشاط nsp9 NMPylation الخاص به، مما يشير إلى أن نشاط nsp12 بوساطة nsp9 NMPylation في المختبر لا يتطلب نشاط البلمرة (ملحق SI، الشكل S4).

بعد إنشاء نشاط NMP Transferase الخاص بـ nsp9 لـ nsp12، حاولنا توصيف ناتج NMP-nsp9 بواسطة قياس الطيف الكتلي (MS).أظهر طيف كتلة البروتين الكامل لـ HCoV-229E nsp9 المؤتلف ذروة عند 12045 دا (الشكل 4A).إضافة nsp12 لم يغير نوعية nsp9، مما يشير إلى أن nsp12 وnsp9 لن يشكلا مجمعًا مستقرًا في ظل الظروف المستخدمة (تمسخ الطبيعة) (الشكل 4A).في وجود UTP وGTP، أظهر قياس كتلة التفاعل الذي يحتوي على nsp9 وnsp12 على التوالي أن كتلة بروتين UTP تحركت 306 دا، وتحركت كتلة بروتين GTP 345 دا، مما يشير إلى أن كل جزيء nsp9 يرتبط بـ UMP أو GMP (الصورة 4) ج و د).من المتوقع أن الطاقة المطلوبة لـ nsp9 NMPylation بوساطة NiRAN تأتي من التحلل المائي NTP وإطلاق البيروفوسفات.على الرغم من استخدام فائض مولي بمقدار 10 أضعاف لـ nsp9 (الهدف) مقارنة بـ nsp12 (الإنزيم) في هذا التفاعل، فقد لوحظ NMPylation شبه كامل لـ nsp9، مما يشير إلى أن التفاعل بين nsp12 وnsp9 قصير العمر، ويمكن لـ nsp12 NMPylate أكثر من nsp9 في جزيء المختبر.

NMPylation واحد لـ nsp9 في وجود nsp12 وUTP أو GTP.يظهر هو طيف كتلة البروتين الكامل المفكك لـ HCoV-229E nsp9 (ملحق SI، الجدول S1) (AD).(A) nsp9 وحده، (B) nsp9 + nsp12-His6، (C) nsp9 + nsp12-His6 في وجود UTP، (D) nsp9 + nsp12-His6 في وجود GTP.

لتحديد بقايا nsp9 UMPylated بواسطة nsp12، تم تقطيع nsp9-UMP باستخدام التربسين.تم فصل الببتيدات الناتجة عن طريق التحليل اللوني السائل عالي الأداء النانوي (HPLC) وتحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي الترادفي (MS/MS) عبر الإنترنت.أظهر تحليل البيانات باستخدام حزمة برامج Byonic (قياسات البروتين) UMPylation للحمض الأميني N-terminal.يتم تأكيد ذلك يدويًا.كشف طيف الكتلة الترادفي للببتيد السلائف [UMP] NNEIMPGK (ملحق SI، الشكل S5A) عن جزء عند 421 م/ض، مما يشير إلى أن UMP يرتبط بالبقايا 1 من nsp9.

عند الطرف N لـ nsp9، يتم حفظ Asn بين أعضاء Orthocoronavirinae (ملحق SI، الشكل S6).على الرغم من أننا نعتقد أن النيتروجين الأميني الأساسي للمحطة N هو المستقبل الأكثر احتمالاً لـ UMP، فقد قررنا الحصول على دليل إضافي على ربط NMP في المحطة N.لهذا السبب، تم اشتقاق الببتيد N-terminal nsp9 غير NMPylated وNMPylated المنقى بواسطة HPLC في وجود الأسيتون وسيانوبوروهيدريد الصوديوم.في ظل هذه الظروف، يمكن فقط تعديل الأمينات الأولية الحرة باستخدام البروبيل (25).يحتوي الببتيد المشتق من N-terminal nsp9 مع التسلسل NNEIMPGK على أمينين أساسيين، أحدهما عند الطرف N لـ Asn والآخر عند السلسلة الجانبية لـ Lys عند الطرف C.ولذلك، يمكن إدخال مجموعات البروبيل في كلا الطرفين.يتم عرض المخططات اللونية الأيونية المستخرجة من الببتيدات غير NMPylated في ملحق SI، الشكل S5B.كما هو متوقع، يمكن تحديد N-terminal وC-terminal (أحادي) (ملحق SI، الشكل S5B، الممر العلوي) والببتيدات ثنائية البروبيل (ملحق SI، الشكل S5B، الممر السفلي).يتغير هذا النمط باستخدام الببتيد NMPylated N لـ nsp9.في هذه الحالة، يمكن تحديد فقط الببتيدات البروبيلية للمحطة C، ولكن لم يتم تحديد الببتيدات البروبيلية للمحطة N والببتيدات ثنائية البروبيل (ملحق SI، الشكل S5C)، مما يشير إلى أنه تم نقل UMP إلى الأمين الأولي للمحطة N لمنع هذا المجموعة من إجراء التغييرات.

بعد ذلك، نستبدل (بـ Ala أو Ser) أو نحذف البقايا المحفوظة عند الطرف N لـ nsp9 لتحديد القيود الخاصة بالهدف.استنادًا إلى بيانات MS الخاصة بنا التي توضح أن NiRAN يشكل مركب nsp9-NMP مع الأمين الأساسي لبقايا الطرف N لـ nsp9، افترضنا أن nsp9 NMPylation يتطلب البروتياز الرئيسي الفيروسي (Mpro، nsp5) لتحرير الطرف Nsp9 من سلائفها من البوليبروتين.لاختبار هذه الفرضية، أنتجنا بروتينًا طليعيًا nsp7-11 يحتوي على nsp9 في الإشريكية القولونية وأجرينا اختبار NMPylation قياسي في وجود [α-32P] UTP (المواد والأساليب).كما هو مبين في الشكل 5A (الخط 3)، فإن سلائف nsp7-11 غير المصقولة غير موسومة بـ nsp12.في المقابل، إذا انفصل nsp7-11 بواسطة nsp5 المؤتلف لتحرير nsp9 (وغيره من nsps) من السلائف، يتم اكتشاف بروتين ذو علامة إشعاعية يهاجر مع nsp9، مما يؤكد استنتاجنا بأن التكوين الانتقائي لـ NiRAN وN للمركب التساهمي nsp9-NMP يقترب .الأمين الأساسي الطرفي لـ N-terminal Asn (الموضع 3825 في pp1a/pp1ab).يتم دعم هذا الاستنتاج أيضًا من خلال التجارب التي تستخدم بنية nsp9، والتي تحتوي على واحد أو اثنين من الوحدات البنائية الإضافية عند الطرف N.في كلتا الحالتين، تم إلغاء UMPylation بوساطة NiRAN لـ nsp9 (ملحق SI، الشكل S7).بعد ذلك، أنتجنا بروتينًا يحتوي على واحد أو اثنين من بقايا Asn المحذوفة من تسلسل الببتيد 3825-NNEIMPK-3832 عند الطرف N لـ nsp9.في كلتا الحالتين، تم حظر nsp9 UMPylation بالكامل (الشكل 5B)، مما يوفر دليلًا إضافيًا على أن الطرف nsp9 N الحقيقي يعمل كمستقبل NMP.

معالجة التحلل البروتيني لـ nsp9 ودور بقايا الطرف N في UMPylation بوساطة nsp12.(أ) يتطلب nsp9 UMPylation محطة nsp9 N مجانية.تم تحضين Nsp7-11-His6 مسبقًا عند 30 درجة مئوية في المخزن المؤقت للكشف عن NMPylation الذي يحتوي على UTP في وجود أو عدم وجود Mpro المؤتلف (nsp5-His6).بعد 3 ساعات، ابدأ اختبار NMPylation بإضافة nsp12-His6 كما هو موضح في المواد والأساليب.تم استخدام التفاعل الذي يحتوي على nsp5-His6 (الخط 1) وnsp9-His6 (الخط 2) كعنصر تحكم.بعد 10 دقائق، تم إنهاء التفاعل وتم فصل خليط التفاعل بواسطة SDS-PAGE.كان البروتين ملطخًا بـ Coomassie Brilliant Blue (A، أعلى).يتم عرض السلائف Nsp7-11-His6 والمنتج المعالج الناتج عن الانقسام بوساطة nsp5-His6 على اليمين.يرجى ملاحظة (بسبب صغر حجمها) أن nsp7 وnsp11-His6 لا يمكن اكتشافهما في هذا الجل، ويتم استكمال التفاعل بـ nsp5-His6 (الممران 1 و4؛ يُشار إلى موضع nsp5-His6 بدائرة صلبة) أو nsp9-His6 (الخط 2) يحتوي على كمية صغيرة من MBP (المشار إليها بالدوائر المفتوحة) كشوائب متبقية لأنه يتم التعبير عنها كبروتينات دمج MBP (ملحق SI، الجدول S1).(ب) يفتقر متغير Nsp9-His6 إلى واحد أو اثنين من بقايا Asn للطرف N (ترقيم البقايا وفقًا للموضع في pp1a/pp1ab) ويتم تنقيته واحتضانه باستخدام nsp12-His6 و[α-32P] UTP.B، يظهر SDS-PAGE الملون بـ Coomassie في الأعلى، B، ويظهر مخطط الأشعة الذاتية المقابل في الأسفل.يظهر موضع علامة الوزن الجزيئي (بالكيلودالتون) على اليسار.(C) تم استبدال المخلفات المحفوظة في محطة HCoV-229E nsp9-His6 N بـ Ala أو Ser، وتم استخدام نفس الكمية من البروتين في تفاعل UMPylation بوساطة nsp12-His6.تم فصل منتجات التفاعل بواسطة SDS-PAGE وملطخة بـ Coomassie Brilliant Blue (C، أعلى)، وتم اكتشاف nsp9-His6 الموسوم بالأشعة بواسطة التصوير الفسفرة (C، الأوسط).باستخدام البروتين من النوع البري (بالوزن) كمرجع (تم ضبطه على 100٪)، تم حساب نشاط NMPylation النسبي (يعني ± SEM) من ثلاث تجارب مستقلة.(D) تم تحديد عيارات الفيروس في طاف ثقافة الخلية p1 لخلايا Huh-7 المصابة بخلايا Huh-7 من النوع البري HCoV-229E، والطفرات التي تحمل بدائل الأحماض الأمينية المعينة في nsp9 بواسطة اختبار البلاك.تم استخدام نموذج RdRp الناقص في النسخ المتماثل C المتحول المزدوج DD4823/4AA كعنصر تحكم سلبي.

يتم الحفاظ على الطرف N لـ nsp9 (خاصة المواضع 1 و 2 و 3 و 6) بشكل كبير بين أعضاء فصيلة Orthocoronavirinae الفرعية (ملحق SI، الشكل S6).من أجل دراسة الدور المحتمل لهذه البقايا في nsp12 بوساطة nsp9 NMPylation، تم استبدال اثنين من بقايا Asn المتتالية عند الطرف N لـ nsp9 بـ Ala أو Ser (وحده أو معًا).بالمقارنة مع nsp9 من النوع البري، أدى استبدال N3825 بـ Ala أو Ser إلى انخفاض أكثر من شقين في UMPylation بوساطة nsp12 (الشكل 5C).تمشيا مع استنتاجنا بأن NMPylation يحدث في الأمين الأولي لـ N-terminal بدلاً من السلسلة الجانبية لبقايا N-terminal، لاحظنا NMPylation كبير متبقٍ مع استبدال N3825A وN3825S.ومن المثير للاهتمام، أنه إذا تم استبدال Asn الثاني بـ Ala أو Ser، فسيتم تقليل nsp9 UMPylation بقوة أكبر (أكثر من 10 مرات)، في حين أن استبدال Ala في المواضع 3 و4 و6 له تأثير معتدل فقط على nsp9 UMPylation (الشكل 2). ) .5 ج).تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام ATP أو CTP أو GTP (ملحق SI، الشكل S8).بشكل جماعي، تشير هذه البيانات إلى الدور الرئيسي لـ N2826 (الموضع 2 في nsp9) في nsp9 NMPylation.

من أجل الحصول على دليل إضافي على الارتباط الوظيفي بين الطرف N لـ nsp9 وNMPylation، أجرينا محاذاة تسلسل متعددة (MSA) لتسلسل nsp9 لعائلة فيروس كورونا (تتراوح بين 104 و113 وحدة بنائية) (ملحق SI، الشكل س6).في المجمل، في 47 نوعًا (معروفًا ومفترضًا) من 5 أجناس من فصيلة Orthocoronavirinae التي تصيب ثدييات وطيور وزواحف مختلفة، تم العثور على 8 بقايا فقط في المجموع لتكون ثابتة.وقد لوحظت التغييرات الأكثر شمولاً، بما في ذلك عمليات الحذف والإدراج، في الدورات بين عناصر البنية الثانوية لـ nsp9، كما حددتها الدراسات الهيكلية السابقة (26؟28).تم العثور على خمسة بقايا ثابتة في الحلزون β والحلزون α للجزء C من الطرف nsp9.تشكل ثلاثة بقايا ثابتة نموذج NNE للمحطة N لـ nsp9.تم الكشف عن أن Asn الثاني لهذا الشكل هو البقايا الثابتة الوحيدة، والتي يتقاسمها أيضًا nsp9 الافتراضي لفيروس كورونا الضفدع ذي الصلة البعيدة، ويمثل نوع Microhyla Letovirus 1 في فصيلة Letovirinae من Alphaletovirus.يمكن ترشيد حفظ البقايا في عناصر البنية الثانوية nsp9 من خلال الاعتبارات الهيكلية للحفاظ على خصائص ربط الحمض النووي الريبي (RNA) القابلة للطي أو المعروفة.ومع ذلك، لا يبدو أن هذا المنطق ينطبق على حفظ NNE، وقبل هذه الدراسة، كانت طبيعة القيود التي تحد من تباين تسلسل ثلاثي الببتيد محجوبة تمامًا.

من أجل تحديد أهمية حفظ nsp9-NMPylation وNNE في تكاثر فيروس كورونا، أنتجنا طفرات HCoV-229E، التي تحمل بدائل مفردة أو مزدوجة لبقايا الطرف nsp9 N، مما يشير إلى أن nsp9 NMPylation ضار في المختبر.قبل أن نبدأ، نحاول الإجابة على سؤال ما إذا كانت هذه البدائل (بالقرب من موقع الانقسام nsp8|9) تؤثر على المعالجة البروتينية لمنطقة C-terminal pp1a.تم إنتاج مجموعة من بنيات البروتين nsp7-11 التي تحتوي على بدائل مقابلة عند الطرف N لـ nsp9 في E. coli وتم قطعها باستخدام Mpro المؤتلف.لا يتأثر الانقسام البروتيني للمواقع الأربعة (بما في ذلك الموقع المجاور لـ nsp9) بشكل كبير بأي بدائل مقدمة (ملحق SI، الشكل S9)، باستثناء التغييرات الهيكلية في هذه البروتينات التي تتداخل مع انقسام nsp8|9 بوساطة Mpro (أو غيره) موقع إلكتروني.

تم نقل خلايا Huh-7 باستخدام HCoV-229E RNA بطول الجينوم، وترميز بدائل Ala أو Ser في ثلاثي الببتيدات NNE المحفوظة (N3825، N3826، وE3827) عند الطرف nsp9 N، مما يدل على أن معظم الطفرات قاتلة.لقد تمكنا من إنقاذ الفيروس عن طريق استبدال Ser أو Ala الخاص بـ N-terminal Asn (N2835A أو N2835S)، لكننا فشلنا في استعادة الفيروس بطفرات مفردة ومزدوجة أخرى في تسلسل NNE (N3826A، N3826S، NN3825/6AA، NN3825/6SS)، E3827A) (الشكل 5D).

تشير هذه النتائج إلى أن تكاثر فيروسات كورونا في زراعة الأنسجة مقيد (نفسه أو مشابه)، مما يحد من الطفرة الطبيعية لمواقع nsp9 NMPylation في الجسم، ويدعم الدور الرئيسي لهذه الاستجابة في دورة حياة فيروسات كورونا.

في المجموعة الأخيرة من التجارب، أنتجنا C-terminal His6 المسمى SARS-CoV-2 nsp12 وnsp9، وشكلين متحورين من nsp12 في الإشريكية القولونية.تم استخدام بقايا الموقع النشط في مجالات NiRAN وRdRp على التوالي بدلاً من ذلك (الشكل 6A وملحق SI، الجدول S2).يتوافق K4465 في SARS-CoV-2 nsp12 مع K4135 في HCoV-229E (ملحق SI، الشكل S2)، والذي ثبت أنه مطلوب لنشاط NiRAN وتكرار HCoV-229E (الشكل ثلاثي الأبعاد وE).تتوافق هذه البقايا أيضًا مع بقايا الفيروس الشرياني EAV nsp9 K94، والتي ثبت سابقًا أنها ضرورية لـ NiRAN self UMPylation / self-GMPylation (16).كما هو موضح في الشكل 6ب، يمتلك SARS-CoV-2 nsp12 نشاط ترانسفيراز UMP باستخدام nsp9 كركيزة، في حين أن متحول الموقع النشط nsp12_K4465A غير نشط.لا يؤثر الاستبدال المزدوج في التسلسل المميز SDD لعزر RdRp C على نشاط ترانسفيراز UMP (الشكل 6B)، مما يشير إلى أن نشاط RdRp ليس له تأثير مباشر في nsp9 UMPylation.تم الحصول على بيانات مماثلة باستخدام CTP وGTP وATP (ملحق SI، الشكل S10).باختصار، تشير هذه البيانات إلى أن nsp9 NMPylation بوساطة NiRAN له نشاط محافظ في الفيروسات التاجية التي تمثل أجناسًا مختلفة من فصيلة الفيروسات التاجية التقويمية.

SARS-CoV-2 nsp12 بوساطة NMPylation لـ nsp9.(أ) جل بولي أكريلاميد SDS الملون من Coomassie يُظهر البروتين المؤتلف المستخدم في اختبار NMPylation.كعنصر تحكم، تم استخدام بروتين متحور مع استبدال الموقع النشط في مجال NiRAN (K4465A) ومجال RdRp (DD5152/3AA) لـ SARS-CoV-2 nsp12.يعتمد ترقيم البقايا على الموضع في pp1ab.(ب) التصوير الشعاعي التلقائي للكشف عن UMPylation باستخدام nsp9-His6 و[α-32P]UTP كركيزة لـ nsp12-His6 (النوع البري [بالوزن] والمتحول).تظهر الكتلة الجزيئية (بالكيلودالتون) للبروتين المسمى على اليسار.

يتم حفظ نطاقات NiRAN عمومًا في Nidovirales (16)، مما يشير إلى أنها تحفز التفاعلات الأنزيمية الضرورية لتكاثر Nidovirus.في هذه الدراسة، تمكنا من إثبات أن مجال NiRAN الخاص بفيروس كورونا ينقل NMP (المتولد من NTP) إلى nsp9، وهو بروتين غامض مرتبط بالـ RNA يشارك في تكاثر الفيروس (26 29)، لتحديده كهدف طبيعي و شريك فيروس كورونا RTC.

يشترك مجال NiRAN في ثلاثة أشكال تسلسلية (AN، وBN، وCN)، والتي تحتوي على عدد صغير جدًا من البقايا التي يتم حفظها في جميع العائلات في ترتيب Nidovirales أحادي اللون ولكن شديد التمايز (8، 16).أظهرت الدراسات الحديثة أنها مرتبطة هيكليًا بعائلة غير مميزة إلى حد كبير من البروتينات الشبيهة بالبروتين كيناز، والتي كانت تسمى في الأصل عائلة SelO (17، 19، 22، 30، 31).تحتوي البروتينات المرتبطة بـ SelO على طيات كيناز، ولكنها تفتقر إلى العديد من بقايا المواقع النشطة المحفوظة في الكينازات الكلاسيكية (22، 32).استنادًا إلى الاتجاه العكسي لجزيئات ATP المرتبطة بالموقع النشط والمستقرة من خلال تفاعلات محددة، تم افتراض SelO وتأكيده لاحقًا لنقل AMP (بدلاً من الفوسفات) إلى الركيزة البروتينية (22)، في حين أن بروتين بكتيري آخر يشبه SelO YdiU لديه تم عرضه مؤخرًا لتحفيز الارتباط التساهمي لـ UMP بـ Tyr ومخلفاته من ركائز البروتين المختلفة (33).

من أجل تأكيد وتوسيع نطاق التنبؤ ببقايا الموقع النشط المفترض لنطاق فيروس كورونا NiRAN، استخدمنا طرق الوراثة البيوكيميائية والعكسية لإجراء تحليل الطفرة على فيروس كورونا nsp12 (الشكل 3D وE وملحق SI، الشكل S3 والجدول) S1â 4 س).تظهر البيانات أن استبدال HCoV-229E K4135 وR4178 وD4280 بـ Ala يلغي نشاط إنزيم ترانسفيراز NMP في المختبر وتكاثر الفيروس في زراعة الخلايا (الشكل 3D وE وملاحق SI، الشكل S3)، مما يدعم وجودها في NTP γ-phosphate (K4135، R4178) وتنسيق أيونات المعادن النشطة في الموقع (D4280).تبين أن استبدال E4145A لـ Glu المحفوظ في نطاق فيروس عش الطائر المتوقع لتحقيق الاستقرار في موضع K4135 (17) قد أدى إلى القضاء على تكاثر الفيروس، ولكن من المدهش أنه تم الاحتفاظ بالنشاط في اختبار NMPylation في المختبر (الشكل ثلاثي الأبعاد وE و ملحق SI، الشكل S3 والجداول من S1 إلى S4).تم إجراء ملاحظة مماثلة عندما تم تقديم الاستبدال المقابل في تماثل YdiU لـ Salmonella typhimurium (E130A) (33).تدعم هذه البيانات مجتمعة الوظيفة التنظيمية لهذه البقايا المحفوظة بدلاً من الوظيفة الحفزية.

أدى استبدال بقايا Phe المحفوظة (F4281A) ضمن نطاق فيروس Nestovirus في مجال HCoV-229E NiRAN (8) إلى انخفاض في نشاط NMPylation في المختبر وانخفاض كبير في تكرار الفيروس في زراعة الخلايا (الشكل ثلاثي الأبعاد وE وSI) الملحق، الشكل S3).تتوافق البيانات مع الوظيفة التنظيمية المهمة لهذه البقايا، مثل بقايا Phe المتماثلة الموضحة سابقًا.في كينازات البروتين الكلاسيكية، يعد جزءًا من حلقة الربط Mg2+ ويساعد على تجميع وتنظيم العمود الفقري.؟؟مطلوب للنشاط التحفيزي الفعال (32، 34).أدى استبدال Ala وArg ببقايا K4116 (في نموذج preAN)، على التوالي، إلى القضاء على التكاثر الفيروسي، وكما هو متوقع، كان له تأثيرات مختلفة على نشاط NMP Transferase في المختبر، اعتمادًا على السلسلة الجانبية للأحماض الأمينية المقدمة (الشكل 3D وE وSI ملاحق ، الشكل S3).تتوافق البيانات الوظيفية مع المعلومات الهيكلية، مما يشير إلى أن هذه البقايا قد أنشأت تفاعلًا مع فوسفات ATP (17).في مجال NiRAN لعائلات الفيروسات المتداخلة الأخرى، يشغل Lys أو Arg أو His (8) موقع HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116، مما يشير إلى أنه تم تخفيف التقييد الوظيفي لهذه البقايا المحددة.استبدال D4188A وD4283A يلغي أو يقلل بشدة من نشاط الإنزيم ويزيل تكرار الفيروس (الشكل 3).يتم حفظ هاتين المخلفات في معظم (ولكن ليس كل) الفيروسات المتداخلة (8)، مما يشير إلى وظيفة مهمة خاصة بالعائلة ولكن ربما غير محفزة.تم استخدام بدائل Ala للعديد من بقايا Lys و Asp الأخرى (K4113A و D4180A و D4197A و D4273A) التي لم يتم حفظها في Coronaviridae أو عائلات Nestioviridae الأخرى (8) كعناصر تحكم.كما هو متوقع، هذه البدائل مقبولة إلى حد كبير، مع انخفاض طفيف في نشاط الإنزيم وتكاثر الفيروس في بعض الحالات (الشكل 3 وملحق SI، الشكل S3).بشكل عام، تتوافق بيانات طفرات فيروس كورونا بشكل كبير مع GMP الذاتي وبيانات الوراثة العكسية لـ EAV NiRAN-RdRp (16)، حيث بقايا EAV nsp9 (فيروس كورونا nsp12 ortholog) K94 (المقابلة لـ HCoV- 229E K4135) وظائف مهمة)، R124 (الموافق R4178)، D132 (الموافق D4188)، D165 (الموافق D4280)، F166 (الموافق F4281).بالإضافة إلى ذلك، تتوافق بيانات الطفرات HCoV-229E مع بيانات الوراثة العكسية لـ SARS-CoV المُبلغ عنها مسبقًا (16) وموسعة منها (16)، تمامًا مثل تلك التي لوحظت في نموذج CN المقابل Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 النمط الظاهري الموصوف -F219A وHCoV-229E_F4281A (الشكل 3 D وE وSI الملحق، الشكل S3 والجدول S1-S4).

بالمقارنة مع أخصائيي تقويم EAV (16)، الذين لديهم تفضيل واضح لـ UTP وGTP (في تفاعل NMPylation الذاتي)، تظهر دراستنا أن مجال فيروس كورونا NiRAN (ممثلًا بـ HCoV-229E وSARS-CoV-2) يمكن أن يكون فعالاً تم نقل جميع NMPs الأربعة، على الرغم من وجود تفضيل طفيف لـ UMP (الشكلان 1 و3).تتوافق الخصوصية المنخفضة نسبيًا للركيزة المشتركة NTP المحددة مع البنية المركبة الفائقة SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 التي تم الإبلاغ عنها مؤخرًا، حيث يرتبط ADP-Mg2+ بالموقع النشط لـ NiRAN، ولكن ليس مع جزء الأدينين لتشكيل تفاعلات محددة (17).في دراستنا، ليس لنوع النوكليوتيدات المستخدم في تفاعل NMPylation أي تأثير تفاضلي على نشاط البروتين المتحول (ملحق SI، الشكل S3)، مما يشير إلى أن أيًا من هذه البقايا لا يرتبط ارتباطًا وثيقًا بربط قاعدة نووية محددة.لا يزال يتعين دراسة الأساس الهيكلي والأهمية البيولوجية المحتملة لتفضيلات الركيزة المشتركة المختلفة لـ NTP التي لوحظت في مجالات NiRAN للفيروسات التاجية والفيروسات الشريانية؛قد تكون صحيحة أو قد تكون بسبب القيود المفروضة على دراساتهم.في الوقت الحاضر، لا يمكن استبعاد أن نشاط NMPylator المحتمل لمجال NiRAN للفيروس الشرياني (مقارنة بنشاط NMPylation الذاتي المميز سابقًا) له تفضيل مختلف للركيزة المشتركة، مع الأخذ في الاعتبار أن التشابه بين الشرياني والفيروس التاجي نطاق NiRAN وصل إلى حدوده.مقارنة على أساس التسلسل (16).بالمقارنة مع pseudokinase SelO، الذي يستخدم Mg2+ كعامل مساعد، فإن نشاط فيروس كورونا والفيروس الشرياني NiRAN يعتمد على Mn2+ (16) (الشكل 3C وملحق SI، الشكل S1).يعد الاعتماد على Mn2+ والتفضيل الواضح لـ UTP سمة غير عادية لبروتين NMPylators، وقد تم تأكيده مؤخرًا فقط في بروتين YdiU الخاص بـ Salmonella typhimurium، والذي يحفز UMPylation الصارم للبروتين المعتمد على Mn2+ لحماية الخلايا من تحريض الإجهاد. 33).

يوفر التشابه الهيكلي الموصوف مؤخرًا بين مجال فيروس كورونا NiRAN وكينازات البروتين الخلوي (17، 19) دعمًا إضافيًا لقدرة NiRAN على ربط NMP تساهميًا بالبروتينات الأخرى التي أبلغنا عنها في هذه الدراسة.ركزنا بحثنا عن أهداف NiRAN المحتملة على البروتينات المشفرة بواسطة HCoV-229E ORF1a، والتي من المعروف أنها تساعد بشكل مباشر أو غير مباشر النسخ المتماثل المشفر ORF1b الخاص بـ RTC (12، 35).توفر تجاربنا دليلاً قاطعاً على NMPylation الفعال والمحدد لـ nsp9 (الشكل 2).إذا تم استخدام البروتين المستهدف في فائض مولي أعلى بـ 8 إلى 10 مرات من الإنزيم (nsp12)، فسيتم التأكد من أن nsp9 (أحادي) NMPized بالكامل (الشكل 4).لقد خلصنا إلى أن التفاعل بين nsp12 وnsp9 قصير الأجل ولن يشكل مجمعًا مستقرًا مع nsp9 (في حالة عدم وجود وحدات فرعية أخرى من RTC).يتم دعم هذا الاستنتاج من خلال دراسات تفاعل البروتين على بروتين SARS-CoV (35).حدد تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد الأمين الأولي لبقايا الطرف N لـ nsp9 كموقع NMPylation (ملحق SI، الشكل S5).يميز تكوين رابطة الفوسفورميدات والمجموعة الأمينية N-terminal نشاط NMPylation بوساطة NiRAN عن تفاعل AMPylation بوساطة Pseudomonas syringae SelO، والذي يحفز تكوين AMP المرتبط بـ O في بقايا Ser أو Thr أو Tyr الببتيد المضاف ( 22)، وS. typhimurium YdiU يشكلان O-linked (مع Tyr) وN-linked (مع His) peptide-UMP adducts.تشير المعلومات المحدودة المتوفرة عن عائلة البروتينات SelO إلى أن أعضاء عائلة البروتين الكبيرة هذه يختلفون بشكل كبير في تكوين مقاربات الببتيد-NMP.وهذه ملاحظة مثيرة للاهتمام وتستحق المزيد من الدراسة.

قادتنا البيانات التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة إلى افتراض أن NMPylation لـ nsp9 يتطلب محطة N مجانية.في سياق التكاثر الفيروسي، سيتم توفير ذلك عن طريق الانقسام البروتيني لموقع المعالجة nsp8|nsp9 في البوليبروتين المتماثل pp1a بوساطة Mpro وpp1ab.في معظم فيروسات كورونا، يكون الفرق بين هذا الموقع المحدد (VKLQ|NNEI في HCoV-229E) وجميع مواقع انقسام فيروس كورونا Mpro الأخرى هو Asn (بدلاً من بقايا صغيرة أخرى، مثل Ala أو Ser أو Gly) التي تشغل P1â؟؟؟الموقع (36).أظهرت بيانات انقسام الببتيد التي تم الحصول عليها في الدراسات المبكرة أن كفاءة الانقسام في موقع nsp8 | nsp9 كانت أقل من تلك الموجودة في المواقع الأخرى، مما يشير إلى أن 1) هذا الموقع المحدد قد يكون له دور تنظيمي في المعالجة المنسقة في الوقت المناسب للمحطة C منطقة pp1a، أو 2) أ دور الطرف Nsp9 الخاص المحفوظ في تكرار الفيروس (37).أظهرت بياناتنا (الشكل 5A) أن الشكل المؤتلف لـ nsp9 الذي يحمل تسلسل N-terminal الحقيقي تم NMPized بشكل فعال بواسطة nsp12.تمت إزالة تسلسل المرافقة للمحطة N بواسطة العامل Xa (nsp9-His6؛ ملحق SI، الجدول S1) أو الانقسام بوساطة Mpro (nsp7-11-His6؛ الشكل 5A وملحق SI، الجدول S1).الأهم من ذلك، أن السلائف غير المقطوعة المحتوية على nsp9 nsp7-11-His6 أظهرت مقاومة لـ NMPylation لـ nsp12، وهو ما يتوافق مع بياناتنا، مما يشير إلى أن ناتج nsp9-NMP يتكون من خلال الأمين الأولي للمحطة N (ملحق SI، الشكل S5) .للحصول على فهم أعمق لخصوصية الركيزة NiRAN، ركزنا بعد ذلك على بقايا N-terminal المجاورة لـ nsp9.في غياب البروتينات الأخرى، تكون مرنة من الناحية الهيكلية، مما يمنع اكتشافها في الشكل غير المسمى لـ nsp9 (26، 28، 38)، مما يشير إلى تنوعها الطبيعي المحدود. ويرجع ذلك إلى التسلسل المهم المحدد (وليس الهيكل الثانوي المرتبط) وظيفة الجزء الطرفي nsp9.تكشف بدائل Ala للمخلفات المحفوظة في هذه المنطقة (الأشكال 5C وD وملحق SI، الشكل S8) أن N3826 ضروري لـ nsp9 NMPylation في المختبر، في حين تؤدي بدائل N3825A وE3827A إلى انخفاض في NMPylation، في حين أن بدائل M3829A وP3830A لا .من الواضح أنها تؤثر على nsp9 NMPylation.على الرغم من أن استبدال N-terminal Asn (N3825A، N3825S) له تأثير معتدل فقط على nsp9 NMPylation وتكاثر الفيروس في زراعة الخلايا (الشكل 5C وD)، فإن حذف تسلسل بقايا Asn من ثنائي الببتيد N-terminal 3825-NN ثبت أنه مميت للفيروسات، مما يشير إلى أن بقايا Asn مطلوبة قبل بقايا أخرى عند الطرف N، ويفضل Asn، على الرغم من أنه يبدو أنه يمكن التسامح جزئيًا مع استبدال المخلفات المماثلة (الشكل 5B وC وD).نستنتج أن ثنائي الببتيد 3825-NN، وخاصة بقايا N3826 المحفوظة والأساسية ضمن نطاق فيروس كورونا (ملحق SI، الشكل S6)، يضمن الارتباط الصحيح والاتجاه للمحطة nsp9 N في الموقع النشط لـ NiRAN.

استبدال Ala (E3827A) للغلو المحفوظ لجميع الفصائل الفرعية يحتفظ بـ nsp9 NMPylation في المختبر ولكنه قاتل للفيروسات في زراعة الخلايا (الشكل 5C وD)، مما يشير إلى الوظيفة الإضافية لهذه البقايا، على سبيل المثال، في التفاعلات الرئيسية (NMPylated أو غير المعدلة ) nsp9 N-terminus والعوامل الأخرى المشاركة في تكاثر الفيروس.لم تؤثر طفرات Nsp9 على عملية التحلل البروتيني لـ nsp9 أو أي nsps مجاورة (39) (ملحق SI، الشكل S9)، مما يشير إلى أن الأنماط الظاهرية المميتة للعديد من طفرات nsp9 التي تمت ملاحظتها لم تكن ناجمة عن خلل تنظيم منطقة pp1a لمحطة عملية التحلل البروتيني C .

توفر البيانات المذكورة أعلاه دليلاً على أنه بعد المعالجة بوساطة Mpro لموقع الانقسام nsp8|9 في pp1a/pp1ab، يمكن UMPylated للنهاية N لـ nsp9 (أو تعديلها جزئيًا باستخدام NMP آخر).بالإضافة إلى ذلك، أدى الحفظ الممتاز للمحطة N لـ nsp9 (بما في ذلك بقايا Asn المفردة والثابتة في عائلة الفيروسات التاجية) وبيانات الوراثة العكسية التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة (الشكلان 3E و5D) إلى استنتاج أن nsp9 NMPylation الموصوف يرتبط بيولوجيًا وضروري لتكاثر فيروس كورونا.لا تزال العواقب الوظيفية لهذا التعديل قيد الدراسة، على سبيل المثال، فيما يتعلق بنشاط ربط الحمض النووي الريبي nsp9 (غير المحدد) الموصوف مسبقًا (نموذج غير معدل) (2628).قد يؤثر NMPylation N-terminal أيضًا على تفاعل nsp9 مع البروتين أو ركائز الحمض النووي الريبي (RNA) أو تكوين مجموعات مختلفة من أربعة مستويات.وقد لوحظت هذه في الدراسات الهيكلية وتم التأكد من أنها مرتبطة وظيفيًا بتكاثر فيروس كورونا، على الرغم من عدم وجود هذا التعديل بشكل خاص (26-29، 40).

على الرغم من أن خصوصية الهدف لنطاق NiRAN لفيروس كورونا لا تزال بحاجة إلى وصفها بمزيد من التفصيل، إلا أن بياناتنا تظهر أن خصوصية هدف البروتين لنطاق NiRAN لفيروس كورونا ضيقة جدًا.على الرغم من أن الحفاظ على بقايا الموقع النشطة الرئيسية (8، 16) في مجال NiRAN لجميع عائلات فيروسات nidovirus يدعم بقوة نشاط NMPylator المحفوظ، إلا أن هوية بقايا جيب ربط الركيزة في هذا المجال لا يزال يتعين تحديد الحفظ والحفظ. ، وقد تختلف أغراض فيروسات النيدو بين العائلات المختلفة.وبالمثل، فإن الأهداف ذات الصلة للفيروسات المتداخلة الأخرى لم يتم تحديدها بعد.قد يكونون متعامدين عن بعد لـ nsp9 أو بروتينات أخرى، لأن التسلسلات خارج نطاقات النسخ المتماثل الخمسة التي يتم حفظها بشكل عام في الفيروسات المتداخلة تكون أقل حفظًا (8)، بما في ذلك مصفوفة الجينوم بين Mpro وNiRAN، ومن بينها، يقع nsp9 في فيروس كورونا.

بالإضافة إلى ذلك، لا يمكننا حاليًا استبعاد احتمال أن يكون لنطاق NiRAN أهداف إضافية (بما في ذلك الخلوية).في هذه الحالة، تجدر الإشارة إلى أن المتماثلات البكتيرية في هذا البروتين الناشئ NMPylators (NMPylators) (30، 31) يبدو أن لديها "منظمات رئيسية"؟يقوم NMP بتعديل مجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية لتنظيم أو القضاء على أنشطتها النهائية، وبالتالي يلعب دورًا في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية، مثل الاستجابة للإجهاد الخلوي وتوازن الأكسدة والاختزال (22، 33).

في هذه الدراسة (الشكلان 2 و4 وملحق SI، الشكلان S3 وS5)، تمكنا من إثبات أن nsp12 نقل جزء UMP (NMP) إلى موضع واحد (محفوظ) في nsp9، بينما لم يتم تعديل البروتينات الأخرى في تستخدم في ظل الظروف، ويتم دعم خصوصية الركيزة محددة جيدا (وليس فضفاضة).تمشيا مع هذا، بالمقارنة مع N-terminal nsp9 NMPylation، نشاط NMPylation الخاص بـ nsp12 منخفض جدًا، ويتطلب اكتشافه وقتًا أطول للتعرض للتصوير الإشعاعي الذاتي، ويتم استخدام زيادة بمقدار 10 أضعاف في تركيز nsp12.بالإضافة إلى ذلك، فشل تحليل MS الخاص بنا في تقديم دليل على NMPylation لـ nsp12، مما يشير إلى أن NMPylation الذاتي لنطاق NiRAN هو (في أحسن الأحوال) نشاط ثانوي.ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن دراسات أخرى قدمت أدلة أولية على أن حالة AMPylation الذاتي للNMPylator البكتيري قد تتحكم في نشاط NMPylation على ركائز البروتين الأخرى (22، 33).لذلك، هناك حاجة إلى مزيد من البحث لاستقصاء التأثيرات الوظيفية المحتملة لأنشطة NMPylation الذاتية المُبلغ عنها لـ EAV nsp9 (16) وفيروس كورونا nsp12 (هذه الدراسة)، بما في ذلك التأثير المقترح الشبيه بالمرافقة على طي مجال RdRp للمحطة C ( 16)).

في السابق، تم النظر في العديد من الفرضيات المتعلقة بالوظائف النهائية المحتملة لمجال NiRAN الفيروسي النيدو، بما في ذلك ligase RNA، و RNA المغطى بـ guanylate Transferase ونشاط تحضير البروتين (16)، ولكن لا يتوافق أي منها مع الوظائف النهائية المتاحة.المعلومات التي تم الحصول عليها في المواقف التالية هي بالضبط نفس الوقت دون تقديم افتراضات إضافية.تتوافق البيانات التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة مع (ولكن لا يمكن إثباتها) أن مجال NiRAN متورط في بدء تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) الناجم عن البروتين.وكان يعتقد سابقا أن وظيفة مجال NiRAN هي 5؟؟²- لا يتأثر تفاعلات ربط الحمض النووي الريبي (RNA) أو ربط الحمض النووي الريبي (RNA) بهذه البيانات ودعم البيانات الأخرى.لذلك، على سبيل المثال، يعتبر الموقع النشط لـ NiRAN يشتمل على Asp المحفوظ كقاعدة عامة (D252 في Pseudomonas syringae SelO؛ D4271 في HCoV-229E pp1ab؛ D208 في SARS-CoV-2 nsp12) (ملحق SI، الشكل 2) ).S2) (17، 22، 33)، في حين يتم تنفيذ التحفيز في إنزيم RNA المعتمد على ATP وإنزيم RNA بواسطة الإنزيم التساهمي- (lysyl-N) -NMP الوسيط، والذي يتضمن بقايا Lys غير متغيرة ( 41).بالإضافة إلى ذلك، فإن الخصوصية الرائعة القائمة على التسلسل لفيروس كورونا NiRAN لأهداف البروتين المحفوظة والخصوصية المريحة للركائز المشتركة NTP (تفضل UTP) تعارض إنزيم السد بوساطة NiRAN أو الوظائف الشبيهة بـ ligase RNA.

من الواضح أن هناك حاجة إلى الكثير من العمل الإضافي للتحقق، وإذا ثبت، توضيح الدور المحتمل لـ nsp9-UMP (nsp9-NMP) في تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) الناجم عن البروتين، والذي سيربط العديد من التقارير المثيرة للاهتمام ولكن (حتى الآن) التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا .ملاحظات معزولة.على سبيل المثال، تم تحديد أن نهاية الحمض النووي الريبي (RNA) السلبي لفيروس كورونا يبدأ بخيط قليل (U) (42، 43).تتوافق هذه الملاحظة مع فكرة أن تخليق الحمض النووي الريبي السالب يبدأ عن طريق ربط الشكل UMPylated من nsp9 بذيل poly(A) (المحفزات)، والذي يمكن تعزيزه من خلال ربط الحمض النووي الريبي (RNA) الخاص به. بروتين RTC آخر.يمكن بعد ذلك استخدام جزء UMP الذي يوفره nsp9 باعتباره "تمهيدًا" لتكوين قليلات البول بوساطة nsp7/8/nsp12، باستخدام ذيل 3??²-poly(A) في الحمض النووي الريبي الجينومي أو تسلسل آخر يحتوي على oligo (A) بمثابة قالب، مشابه للآلية التي تم إنشاؤها لبروتين VPg لفيروس picornavirus (44).ماذا لو كان الاقتراح "غير معياري"؟؟؟؟يوفر بدء تخليق الحمض النووي الريبوزي (RNA) سالب الجديلة (المستحث بالبروتين) رابطًا للملاحظات، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبوزي (RNA) السلبي لفيروس كورونا يحتوي على UMP (بدلاً من UTP) في نهايته (42)، وهو ما يعتبر إشارة إلى أن يشق الحمض النووي Dicer النهاية المفسفرة بواسطة نوكلياز داخلي مجهول خاص باليوريدين.إذا تم تأكيد ذلك، فإن هذا النشاط المائي للحمض النووي يمكن أن يساعد في إطلاق الشكل قليل القسيم UMPylated من nsp9 من الطرف 5² للشريط السالب الناشئ.يتوافق الدور المحتمل لـ nsp9 في تحضير البروتين أيضًا مع دراسات الوراثة العكسية السابقة، والتي أظهرت أن nsp9 (و nsp8) يتفاعلان بشكل نقدي ومحدد مع عنصر الحمض النووي الريبي (RNA) المحفوظ والمؤثر بالقرب من الطرف الثالث لجينوم فيروس كورونا.45).ووفقا لهذا التقرير، يمكن الآن إعادة النظر في هذه الملاحظات السابقة وتوسيع نطاقها من خلال مزيد من البحث.

باختصار، حددت بياناتنا النشاط المحدد لعلامة إنزيم الفيروس المتداخل الخاص والمرتبط بـ RdRp عند الطرف N.في فيروس كورونا، يتم استخدام نشاط UMPylator/NMPylator المكتشف حديثًا بوساطة NiRAN للاعتماد على Mn2+ وبقايا Asn المجاورة ويتسبب في تكوين روابط فوسفورميدات (منخفضة الطاقة) مع الأمين الأولي للمحطة N.من خلال الانقسام بوساطة Mpro في موقع الانقسام nsp8 | 9، يمكن استخدام هدف nsp9 في NMPylation، مما يشير إلى الاقتران الوظيفي بين البروتياز ومجال NiRAN، والذي يمتد إلى RdRp.يوفر الحفاظ على المخلفات الرئيسية في موقع nsp12 NiRAN النشط وهدف nsp9، جنبًا إلى جنب مع البيانات التي تم الحصول عليها من فيروسين تاجيين بما في ذلك SARS-CoV-2، دليلًا قويًا على أن nsp9 NMPylation هو فيروس تاجي، كما تعد الميزات المحافظة أيضًا خطوة رئيسية في تكاثر الفيروس.تقودنا البيانات المتاحة إلى استنتاج أن الدور المحدد للشكل NMPylated من nsp9 في تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) الناجم عن البروتين هو سيناريو معقول لفيروس كورونا والفيروسات المتداخلة الأخرى، وقد يستهدف NiRAN أيضًا بروتينات أخرى غير محددة.تنظيم الفيروس.تفاعل المضيف.إذا تم تأكيد ذلك، فإن مشاركة بادئات البروتين في تخليق الحمض النووي الريبي الفيروسي (RNA) سيزيد من تقارب التسلسل لنطاقات Mpro/3CLpro وRdRp بين فيروس كورونا المكتشف مسبقًا والمجموعة الفائقة الشبيهة بالفيروسات البيكورناوية (9)، والتي تم توحيدها الآن في Pisonivirites التي تم إنشاؤها مؤخرًا ( 46) في الفئة.

تظهر بياناتنا أيضًا أن أنشطة الإنزيم الأساسية والانتقائية والمحافظة المحددة في هذه الدراسة يمكن استخدامها كأهداف للأدوية المضادة للفيروسات.يمكن تطوير المركبات التي تتداخل مع الارتباط (والتعديل اللاحق) للطرف nsp9 N المحفوظ في الموقع النشط لـ NiRAN إلى أدوية مضادة للفيروسات فعالة ومتعددة الاستخدامات، ومناسبة لعلاج فيروسات كورونا الحيوانية والبشرية من أنواع العدوى (الفرعية) المختلفة. ، بما في ذلك السارس-CoV-2 ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية فيروس كورونا.

تم تضخيم تسلسل ترميز بروتين فيروس كورونا المنتج في هذه الدراسة بواسطة RT-PCR باستخدام الحمض النووي الريبي (RNA) المعزول من Huh-7 المصاب بفيروس HCoV-229E أو Vero E6 المصاب بفيروس SARS-CoV-2، وإدخاله باستخدام إجراءات الاستنساخ القياسية.pMAL-c2 (مختبر نيو إنجلاند البيولوجي) أو ناقل التعبير pASK3-Ub-CHis6 (47) (ملحق SI، الجدولان S1 وS2).تم تقديم بدائل الكودون الفردي عن طريق الطفرات الموجهة للموقع المستندة إلى PCR (48).لإنتاج بروتين الاندماج MBP، تم تحويل خلايا E. coli TB1 باستخدام بنية البلازميد pMAL-c2 المناسبة (ملحق SI، الجدول S1).تمت تنقية بروتين الاندماج بواسطة كروماتوجرافيا تقارب الأميلوز وتشريحه بالعامل Xa.بعد ذلك، تمت تنقية البروتين ذو العلامة His6 للمحطة C بواسطة تحليل كروماتوجرافيا تقارب المعدن المثبت بالنيكل (Ni-IMAC) كما هو موصوف سابقًا (49).لإنتاج بروتين دمج اليوبيكويتين، استخدمت خلايا E. coli TB1 البنية البلازميدية المناسبة pASK3-Ub-CHis6 (ملحق SI، الجدولان S1 وS2) والحمض النووي البلازميد pCGI الذي يشفر هيدرولاز C- الطرفي الخاص باليوبيكويتين 1 (Ubp1).التحول (47).تمت تنقية بروتين فيروس كورونا ذو العلامة C-Terminal His6 كما هو موضح سابقًا (50).

تم إجراء اختبار NMPylation الذاتي لـ HCoV-229E nsp12-His6 كما هو موضح في EAV nsp9 (16).باختصار، يحتوي nsp12-His6 (0.5 ميكرومتر) على 50 مم 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبيرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES)-KOH، درجة الحموضة 8.0، 5 مم ديثيوثريتول (DTT)، 6 مم MnCl2، 25 ميكرومتر عازلة، احتضان NTP المحدد و 0.17 ميكرومتر المطابق [α32-P] NTP (3000 Ci / mmol؛ Hartmann Analytic) عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.في جميع فحوصات NMPylation (القياسية) الأخرى لـ nsp9 NMPylation بوساطة nsp12، يتم ضبط ظروف التفاعل على النحو التالي: nsp12-His6 (0.05 ميكرومتر) وnsp9-His6 (4 ميكرومتر) في وجود 50 مم HEPES-KOH (درجة الحموضة 8.0) ) ، 5 مم DTT، 1 مم MnCl2، 25 ميكرومتر يشير إلى NTP، و0.17 ميكرومتر مطابق [α32-P]NTP.بعد الحضانة لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية، تم خلط عينة التفاعل مع المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE: 62.5 ملي مولار تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 100 ملي مولار DTT، 2.5% SDS، 10% جلسرين و0.005% بروموفينول أزرق.تم تغيير طبيعة البروتين عن طريق التسخين عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وفصله بنسبة 12٪ SDS-PAGE.تم تثبيت الجل وصبغه بمحلول Coomassie Brilliant Blue (40% ميثانول، 10% حمض أسيتيك، 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250)، تم إزالة لونه وتعريضه لشاشة تصوير فسفوري لمدة 20 ساعة (للكشف عن nsp12 من NMPylation). أو (كحد أقصى) ساعتين (لتقييم nsp9 NMPylation).تم استخدام جهاز تصوير Typhoon 9200 (GE Healthcare) لمسح الشاشة وتم استخدام ImageJ لتحليل شدة الإشارة.

لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد، تم استخدام 1 ميكرومتر nsp12-His6 و 10 ميكرومتر nsp9 (بدون علامة هيكساهيستيدين) في تحليل NMPylation (ملحق SI، الجدول S1) وتم استخدام التركيز المتزايد البالغ 500 ميكرومتر UTP وGTP.اعتمادًا على تركيزها وجودة البروتين المتوقعة، تم استخدام نظام Waters ACQUITY H-Class HPLC المجهز بعمود MassPrep (المياه) لتحلية 1 إلى 10 ميكرولتر من محاليل البروتين المخزنة عبر الإنترنت.تتم تصفية البروتين المملح في مصدر أيون الرذاذ الكهربائي لمطياف الكتلة Synapt G2Si (المياه) من خلال التدرج التالي للمخزن المؤقت A (الماء/0.05% حمض الفورميك) والمخزن المؤقت B (حمض الأسيتونيتريل/0.045% حمض الفورميك)، وتكون درجة حرارة العمود هي 60 درجة مئوية ومعدل تدفق 0.1 مل/دقيقة: الشطف بشكل متساوي مع 5% A لمدة دقيقتين، ثم التدرج الخطي إلى 95% B خلال 8 دقائق، والحفاظ على 95% B لمدة 4 دقائق أخرى.

تم الكشف عن الأيونات الموجبة ذات نطاق كتلة يتراوح بين 500 إلى 5000 م/ي.يتم قياس Glu-fibrinopeptide B كل 45 ثانية لتصحيح انحراف الكتلة تلقائيًا.استخدم برنامج أداة MassLynx مع امتداد MaxEnt1 لتفكيك الطيف المتوسط ​​بعد خصم خط الأساس والتمهيد.

تم هضم UMPylated HCoV-229E nsp9 عن طريق إضافة التربسين المعدل بدرجة التسلسل (Serva) واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية.تم استخدام عمود الدوران Chromabond C18WP (رقم الجزء 730522؛ Macherey-Nagel) لتحلية الببتيدات وتركيزها.أخيرًا، تم إذابة الببتيد في 25 ميكرولتر من الماء، والذي يحتوي على 5٪ أسيتونيتريل وحمض الفورميك 0.1٪.

تم تحليل العينات بواسطة MS باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).نظام HPLC النانو النهائي (Dionex)، مجهز بتركيبة نهائية مخصصة مقاس 50 سم؟؟عمود C18 RP بطول 75 ميكرومتر معبأ بخرز مغناطيسي 2.4 ميكرومتر (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) اتصل بمطياف الكتلة عبر الإنترنت من خلال مصدر Proxeon nanospray؛حقن 6 ميكرولتر من محلول هضم التربسين في قطر داخلي 300 ميكرومتر ×؟؟1 سم عمود التركيز المسبق C18 PepMap (الحرارية العلمية).باستخدام الماء/0.05% حمض الفورميك كمذيب، تم محاصرة العينة تلقائيًا وتحليةها بمعدل تدفق قدره 6 ميكرولتر/دقيقة.

تم استخدام التدرجات التالية من حمض الفورميك المائي/0.05% (المذيب A) و80% أسيتونيتريل/0.045% حمض الفورميك (المذيب B) لتحقيق فصل الببتيدات التربتية بمعدل تدفق 300 نلتر/دقيقة: 4% B لـ 5 دقائق، ثم 30 تدرج خطي إلى 45% B خلال دقائق، وزيادة خطية إلى 95% مذيب B خلال 5 دقائق.قم بتوصيل العمود الكروماتوغرافي بباعث نانو من الفولاذ المقاوم للصدأ (Proxeon)، ثم قم برش الشاطف مباشرة على الشعيرات الدموية الساخنة لمطياف الكتلة باستخدام إمكانات تبلغ 2300 فولت. ويرتبط مسح المسح بدقة 60000 في محلل الكتلة Orbitrap مع ما لا يقل عن ثلاث عمليات مسح لبيانات MS/MS، يتم استبعادها ديناميكيًا لمدة 30 ثانية، باستخدام التفكك الناجم عن تصادم الأيونات الخطية أو تفكك تصادم الطاقة الأعلى جنبًا إلى جنب مع الكشف عن Orbitrap، والدقة هي 7500.